La EMA (2014) [1] y la PDA TR49 (2010) [2] aclaran algunos aspectos de la validación de la limpieza para las macromoléculas terapéuticas, pero no proporcionan ninguna posición clara sobre la definición de los límites de aceptación.

Para simplificar y basándose en un fundamento científico, los procedimientos biotecnológicos se consideran procesos "autolimpiables" debido a:

• productos de desnaturalización (o degradación), generados por el propio proceso de limpieza (la alta temperatura y los agentes de limpieza como los surfactantes, las soluciones ácidas o alcalinas juegan una función relevante).

• varias etapas de purificación realizadas en la fase posterior para eliminar las impurezas del proceso.

De acuerdo con este principio, las directrices "históricas" que definen los requisitos de las GMP para la validación de la limpieza de los IPA (es decir, ICH Q7 [3], Anexo 15 [4], PIC/S [5] y APIC [6]) establecen que puede no ser necesaria ninguna actividad de validación de la limpieza para las primeras etapas del proceso si se demuestra la eficacia de las etapas de purificación.

Sin embargo, debido a la complejidad de los procesos biotecnológicos (una mezcla de células, medio, metabolitos, etc.) para los productos biotecnológicos, normalmente no se realiza una identificación de los productos de degradación tras la limpieza para confirmar que estas impurezas específicas se eliminan durante el proceso posterior. Esto da lugar a:

• la imposibilidad de poder establecer de una vez por todas los límites de aceptación de los residuos en las superficies de contacto del producto después de la limpieza;

• la necesidad de proporcionar justificaciones sólidas si se aplican diferentes criterios de aceptación para los equipos anteriores y posteriores.

A diferencia de los productos químicos acabados, en el caso de los productos biotecnológicos no se puede aplicar la hipótesis de que, para un tren de equipos, el 100% de las impurezas que se transfieren al producto final, ya que los pasos de purificación a lo largo del proceso de fabricación contribuyen a su eliminación.

Por esta razón, deben aplicarse sabiamente diferentes límites de aceptación para los equipos anteriores y posteriores (upstream and downstream). Este enfoque se basa en el principio de que la desnaturalización o la degradación por parte de los agentes de limpieza sólo conduce a los aminoácidos, que se eliminan totalmente durante las etapas de purificación.

Basándose en esta justificación, es razonable para:

• establecer límites de aceptación para los equipos después de la última etapa de purificación (normalmente una filtración tangencial, FT).

• asumir en general un factor de corrección de 5 a 10 para los equipos utilizados en las primeras etapas del proceso de fabricación, como se indica en la norma PDA TR 49.

En la actualidad, no se ha establecido ningún fundamento científico que justifique el enfoque mencionado. No obstante, según el EudraLex Vol. 4 Anexo 15 [1], es bien sabido que los productos biológicos son sensibles al hidrólisis en condiciones extremas de pH y/o alta temperatura (condiciones típicas aplicadas para las operaciones de limpieza).

De acuerdo con los principios de validación, estos parámetros se estudian y ajustan durante el desarrollo de los procesos de limpieza para mejorar el procedimiento de limpieza, pero las impurezas producidas por la hidrólisis rara vez se caracterizan.

Aunque la desnaturalización o la degradación de las proteínas biológicamente activas suele dar lugar a fragmentos inactivos, la falta de identificación de las impurezas no garantiza la completa seguridad de los residuos de la limpieza.

De acuerdo con el enfoque descrito en la norma ICH Q7 [3]:

• la contribución de cada etapa del proceso debe considerarse por separado, con el fin de eliminar las impurezas;

• debe aplicarse un criterio de aceptación específico para el equipo utilizado entre estas etapas.

Sobre la base de los criterios de aceptación más preventivos aplicados a los equipos utilizados para los productos farmacéuticos acabados químicamente (es decir, que todos los contaminantes presentes en la superficie del equipo pueden transferirse al producto siguiente), los criterios de aceptación se ajustan en función de la proporción de reducción de cada segmento del proceso.

Dicho esto, hay que tener en cuenta dos tipos de reducción de los residuos de limpieza:

• Fragmentación del flujo de producto

• Etapas de purificación

Fragmentación del flujo de productos
La fragmentación de la corriente del producto consiste en una separación física (por ejemplo, por precipitación, centrifugación o filtración en profundidad) de los fragmentos grandes y pequeños, de los residuos solubles e insolubles. Esto conduce a la eliminación de una parte de las impurezas, ya que sólo una parte del material inicial participa en la siguiente etapa del proceso.

El criterio aplicado a estos pasos supone que

• sólo una parte de los residuos proteicos se encuentra en el proceso posterior;

• a falta de caracterizaciones/cuantificaciones de las impurezas antes y después de la purificación, no se puede especificar la proporción de eliminación

• la reducción de los residuos de limpieza se produce a través de las etapas de purificación del proceso de fabricación

Pasos de Purificación
Centrándonos en los pasos de purificación

• sólo limitan la transferencia de contaminantes al siguiente paso;

• la eficacia de la eliminación y la naturaleza de las impurezas eliminadas dependen principalmente del método de purificación.

Dado que las condiciones de limpieza tienen un impacto relevante en la degradación de las proteínas, la eficiencia de la purificación puede ser variable. El porcentaje de eliminación durante esa fase sigue siendo "teórico", pero si se realiza un análisis de los residuos de limpieza durante o después del desarrollo es posible definir una proporción aproximada de eliminación.

Un paso típico de purificación es la cromatografía, que purifica el producto de interés mediante la unión con una fase estacionaria adecuada colocada dentro de una columna. Sin embargo, hay que tener en cuenta que

• los fragmentos procedentes del procedimiento de limpieza con epítopos de unión al ligando también pueden interactuar con el medio;

• la mayoría de los residuos se eliminan con el lavado de la resina, pero otros permanecen en la elución final.

Para identificar los principales residuos de degradación resultantes de los pasos de purificación, deben realizarse estudios de caracterización. Los experimentos de laboratorio en los que se aplican las condiciones reales de limpieza (es decir, la concentración del agente limpiador, la temperatura y el tiempo de contacto) permiten obtener los residuos de degradación, que luego se caracterizan por LC-MS o por métodos más sencillos (por ejemplo, SDS-PAGE, cromatografía de filtración en gel, etc.).

Estos estudios son decisivos para evaluar el riesgo de su presencia en el producto acabado y justificar su seguridad.

Tras la identificación de los residuos de limpieza, deben realizarse estudios de modelos a escala reducida para justificar el porcentaje de eliminación aplicado para el cálculo del criterio de aceptación de cada parte del proceso de fabricación.

En esta fase, se puede utilizar un factor correctivo (de seguridad) para tener en cuenta la variabilidad para el mejor control, la eliminación de las impurezas y para garantizar que se alcanza el criterio de aceptación previsto. El factor corrector sigue siendo empírico porque no se basa en datos científicos.

Las ventajas de este nuevo enfoque son ciertas:

• proporciona todos los fundamentos científicos necesarios para la justificación de los criterios adoptados;

• permite comprobar la hipótesis de que los procesos de fabricación son "autolimpiables";

• gracias a la caracterización de los residuos de limpieza, también será posible aportar pruebas de su no toxicidad.

Además del valor científico de este enfoque, la metodología ofrece ventajas económicas. En efecto, los estudios a pequeña escala y de bajo coste pueden aplicarse rápidamente y garantizar la fiabilidad de los procesos de limpieza a escala industrial.

Entonces… ¿Qué esperar?
Las sustancias farmacéuticas biotecnológicas son cada vez más importantes en el mundo farmacéutico y representan un reto para el futuro próximo desde varios puntos de vista, incluido el de las validaciones de limpieza.

Por ello, es importante sensibilizar a las empresas que trabajan en este sector sobre la dinámica más reciente de la validación de la limpieza y sobre los posibles nuevos enfoques desarrollados específicamente para estos nuevos tipos de productos.

Al mismo tiempo, es necesario seguir actualizando las directrices "históricas" para que sigan siendo actuales e implementen nuevos conceptos aplicables más específicamente al sector de la biotecnología.

[1] Guideline on setting health based exposure limits for use in risk identification in the manufacture of different medicinal products in shared facilities 20November 2014
[2] PDA Technical Report N° 49 Point to Consider for Biotechnology Cleaning Validation 2010
[3] ICH Q7 (EU GMP Part II)
[4] EU GMP Guide Annex15 “Qualification and Validation”
[5] PIC/S PI-046 (2018) – “Guideline On Setting Health Based Exposure Limits For Use In Risk Identification In The Manufacture Of Different Medicinal Products In Shared Facilities”
[6] Active Pharmaceutical Ingredients Committee (APIC). “Guidance On Aspects Of Cleaning Validation In Active Pharmaceutical Ingredient Plants”